8.4 冷冻方法gUv试管婴儿网

（一）平衡冷冻法gUv试管婴儿网

胚胎冷冻的先驱Mazur提出的这一概念，也就是我们俗称的程序冷冻或慢速冷冻法。平衡冷冻法中，将胚胎放入含有一定浓度冷冻保护剂的冷冻液中处理后，慢速降温（0.2～2.0℃/min)至一个较低的温度（-80～-35℃)。在降温过程中胚胎会继续脱水。平衡冷冻法已经应用多年，技术成熟, 效果稳定，广泛地应用于IVF中原核期到囊胚期胚胎的冷冻保存，目前的IVF临床中，采用平衡冷冻技术来冷冻保存早期胚胎仍占主导地位。IVF有关的试剂公司能够提供多种冷冻和复苏试剂盒。gUv试管婴儿网

平衡冷冻法也用于精子和卵母细胞的冷冻保存。gUv试管婴儿网

多数平衡冷冻法的方案中均包含以下几个关键步骤：gUv试管婴儿网

1） 将胚胎放入含有渗透性冷冻保护剂的溶液中初步脱水，平衡；gUv试管婴儿网

2） 然后将胚胎放入含有渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂的溶液中进一步脱水；gUv试管婴儿网

3） 采用一定的降温程序，将胚胎及冷冻液体慢速降温到-80℃左右使胚胎进一步脱水，此过程中脱水原理是细胞外的冰晶形成；gUv试管婴儿网

4）为了促使细胞外冰晶形成，在降温的适当时期要使用“植冰“的技术；gUv试管婴儿网

5）降温结束后将胚胎放入液氮中储存；gUv试管婴儿网

6）复温时将胚胎快速升温到生理温度；gUv试管婴儿网

7）复温后应用含有非渗透性冷冻保护剂的复苏液使胚胎逐步复水，去除细胞内的渗透性冷冻保护剂。gUv试管婴儿网

(1)基本原理：在平衡冷冻法程序中的脱水阶段，胚胎被放入含有一定浓度渗透性冷冻保护剂的冷冻液中。此时细胞外的渗透压较高，细胞内的水透过细胞膜流向细胞外，虽然此时渗透性冷冻保护剂也可以从高浓度的细胞外进入细胞内，但由于水的渗透速度更快，因此在刚进入冷冻液的开始阶段，随着水渗出细胞外，细胞体积因脱水而出现明显的皱缩。但随着时间的推移，细胞外的渗透性冷冻保护剂也逐渐进入细胞内，使细胞体积停止收缩，转而逐渐膨胀，直至恢复接近原来的大小。也就是出现细胞“先变小，后变大” 的现象，这一过程的长短与细胞的大小、细胞膜的通透性、冷冻保护剂的种类、温度均有关。较高温度下、较小的细胞、渗透性强的冷冻保护剂可以达到更快的平衡。gUv试管婴儿网

随后，通常将胚胎转移至含非渗透性冷冻保护剂的冷冻液中进一步增加细胞外的渗透压，使细胞持续脱水，体积进一步减少（图8-2)。以利于在随后的冷冻过程中，尽量减少冰晶的形成。gUv试管婴儿网

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平衡后的胚胎开始程序降温，当温度降到冷冻液的冰点以下时，需要进行植冰，诱导冰晶逐步形成，冰晶的形成，导致细胞外液体浓度增加，伴随着胚胎的进一步脱水，直至温度降到-80℃左右，进入液氮。gUv试管婴儿网

(2)植冰：是指当冷冻溶液的温度下降至其冰点以下的某个温度时（通常为-7～-5℃)，采用人工的方法诱发冷冻液内（细胞外）冰晶形成的操作，以终止溶液在降温中发生的过冷状态。gUv试管婴儿网

1)过冷状态：在温度下降的过程中，当温度刚冷却至冰点以下时，含水的溶液如果没有合适的冰晶“种子”，则不发生在冰晶形成，也就是不结冰，这种现象就是过冷现象。有时温度可以远远低于冰点，例如含有DMSO的磷酸盐溶液的冰点是-3℃,但是如果将它缓慢降温同时不诱导冰晶形成，那么在冰晶自发形成之前可以降温至-21℃€而不结冰。过冷液体是不稳定的，只要在此液体中投入少许该物质的晶体，便可诱发结冰。而冰晶一旦形成，由于水形成冰晶是放热的过程，结果会使细胞外的冰水混合物温度上升，并且在继续形成冰晶的过程中持续一段时间，这段时间被称为“热平台”。gUv试管婴儿网

过冷现象会对胚胎冷冻造成危害，原因包括温度和冰晶形成两方面。gUv试管婴儿网

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