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冷冻保护剂

作者:孙正怡 来源:人民卫生出版社 2015-08-22 15:48:07

核心提示: 1.3 冷冻保护剂冷冻保护剂指的是所有能够在冷冻复苏过程中保护胚胎内细胞、预防或减轻冷冻损伤的化学成分。冷冻保护剂必须具有高度的水溶性,这样才能在冰晶形成的过程中,随

 1.3 冷冻保护剂hyg试管婴儿网

冷冻保护剂指的是所有能够在冷冻复苏过程保护胚胎内细胞、预防或减轻冷冻损伤的化学成分。hyg试管婴儿网

冷冻保护剂必须具有高度的水溶性这样才能在冰晶形成的过程中随着浓度的增加仍然留在溶液中而不析出。另外为了保证胚胎的发育能力冷冻保护剂必须具备胚胎毒性低的特点。但是要注意的是胚胎在较高的温度下长时间地暴露于高浓度的冷冻保护剂中,胚胎的代谢仍将会受到这些保护剂的不良影响。hyg试管婴儿网

冷冻保护剂通过脱水、调整渗透、减少细胞内冰晶的形成并促进玻璃化、稳定细胞内蛋白质、调节细胞外电解质的作用来保护细胞在冷冻复苏过程免遭损伤。hyg试管婴儿网

冷冻保护剂能够帮助细胞脱水,防止细胞内冰晶形成。在细胞外液加入冷冻保护剂后,细胞外渗透压增加,超过生理情况下300mOsm/L使细胞内的水经过细胞膜渗透到细胞外;另外当细胞外液体中渗透压增加后,溶液的冰点降低,随着温度缓慢下降,细胞外形成冰晶,细胞外的渗透压进一步增加冰点也随之改变,因此在降温过程中,细胞仍在逐步脱水。hyg试管婴儿网

冷冻保护剂能够减弱高渗透性环境对胚胎的伤害。当细胞暴露于高渗透压的环境时,细胞内水分逐渐渗至细胞外,其中细胞内蛋白质、RNADNA 等生物大分子的结合水也可能脱离冷冻保护剂可以置换水分子而维持这些生物大分子的功能。hyg试管婴儿网

冷冻保护剂除了在降温过程中通过提细胞外的渗透压促进细胞的脱水,在复温过程中也有重要作用。通过在复苏液内添加适当的冷冻保护剂(通常为蔗糖),可以提高细胞外的渗透压,减少细胞内外渗透压的差距,防止复苏时水过快地进入细胞内导致渗透性休克。hyg试管婴儿网

冷冻保护剂从生物化学特性上分为渗透性冷冻保护剂非渗透性冷冻保护剂和其他冷冻保护剂。hyg试管婴儿网

1.3.1 渗透性冷冻保护剂hyg试管婴儿网

渗透性保护剂,又名细胞内冷冻保护剂。通常为水溶性强的小分物质,在冷冻过程中可以较快速地进入细胞内,降低细胞内外之间渗透压的差异,减缓细胞内水分渗出造成的细胞体积皱缩的程度和速度,并且能够减少冰晶的形成,还可以与细胞内生物大分子(蛋白质、DNARNA)结合,替代这些分子本来的结合水水外套),避免这些生物大分子的构形发生变化。这类冷冻保护剂从化学的角度分,可分为DMSO和醇类(乙二醇、丙二醇和甘油)。这些有机物的共同特性是:①具有良好的水溶性。②相对分子质量小,多在63~97。③能自由穿越细胞膜,迅速渗透入细胞内。④这些化合物细胞毒性弱。需要警惕的是几乎所有渗透性冷冻保护剂均为易燃液体,在胚胎实验室内保存需要注意防火。hyg试管婴儿网

()乙二醇(ethylene glycol, EG)hyg试管婴儿网

分子式C2H602分子量62.07hyg试管婴儿网

乙二醇是在常用的渗透性冷冻保护剂中分子量最小,因而进入细胞的渗透作用也比较快毒性小,乙二醇的水溶液冰点明显降低,在工业上一直作为抗冻剂,近年来成为玻璃化冷冻的首选冷冻保护剂。hyg试管婴儿网

(二)丙二醇(12-propanediol, PROH)hyg试管婴儿网

分子式C3H8O2分子量76.07hyg试管婴儿网

与甘油或DMSO相比,浓度高时毒性比较低,而且PROH对细胞的渗透性很好。因此在胚胎冷冻过程中可以采用比较短的平衡时间,从而进一步减少毒性作用。近年来,PROH广泛应用于人类和其他动物的囊胚和早期胚胎的冷冻被多数中心公认为是胚胎程序冷冻法保存的首选冷冻保护剂。PROH对卵母细胞也有很好的渗透性可以缩短平衡时间并减少毒性作用,近年来也被广泛应用于卵母细胞的程序冷冻过程。hyg试管婴儿网

()丙三醇(甘油)hyg试管婴儿网

分子式C3H8O2分子量92.09黏稠,在工业和医药领域有非常广泛的用途。它是人类最早发现的冷冻保护剂。曾在冷冻保护剂的研究中起到非常大的作用。hyg试管婴儿网

DMSOPROH,甘油加细胞外液体中进出胚胎细胞的速度慢,尤其是对于早期分裂期胚胎, 渗透速度慢,冷冻效果不理想,但甘油能够成功应用于桑葚胚和囊胚的程序冷冻。在冷冻过程中,甘油与细胞内水分及电解质结合,维持水合蛋白结构的稳定,在精的冷冻过程中也有良好的抗冻作用。在慢速冷冻期间,甘油在临界温度阶段发挥作用。但在玻璃化冷冻时,细胞内仍有较多的冰晶形成,甘油保护作用差。hyg试管婴儿网

(四)二甲基亚砜(dimethyl  sulfoxide, DMSO)hyg试管婴儿网

二甲基亚砜分子式为CH3)2SO, 分子最为78.12常温下为无色无臭的透明液体,与前面的几种醇类化合物不同,DMSO是一种含硫有机化合物也是比较早发现的冷冻保护剂,在过去的30年中广泛用于各种细胞的冷冻,DMSO还是第一个被用于人类胚胎冷冻的冷冻保护剂。hyg试管婴儿网

DMSO多用于分裂期胚胎,尤其是第三天的胚胎。它在许多种类的细胞冷冻中能起到保护作用。但高浓度长时间地暴露于DMSO可能对细胞产生毒性果糖-16-二磷酸的功能可能受损另外DMSO可能与蛋白质发生不可逆性结合,因而DMSO在人类胚胎冷冻中的应用已经明显减少。由于DMSO渗透速度快,目前仍用于人胚胎的玻璃化冷冻。但试验证明,DMSO对人类精液的冷冻保护效果不佳。hyg试管婴儿网

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