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未成熟卵母细胞的体外成培养

作者:严杰 来源:人民卫生出版社 2015-08-24 16:36:54

核心提示: 1.4 未成熟卵母细胞的体外成培养人类卵子在卵泡发育期(卵子的生长和成熟)需要获得一系列为保证受精和早期胚胎发育所需要的能力。体外培养环境对于卵子IVM的影响非常

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人类卵子在卵泡发育期(卵子的生长和成熟)需要获得一系列为保证受精和早期胚胎发育所需要的能力。体外培养环境对于卵子IVM的影响非常大。虽然目前已有很多来自动物学研究的数据,但是卵子IVM 培养液的选择依据依旧是来源于其他细胞种类。tdN试管婴儿网

不同的能量和营养物质可以在很大程度上影响卵子的核成熟和胞质成熟。葡萄糖、丙酮酸盐和乳酸盐是体细胞和卵子能量代谢的主要底物。对于仓鼠和兔卵,谷氨酸也可以被作为能量代谢底物来促进体外的核成熟。卵子对于丙酮酸盐的吸收利用需要依靠颗粒细胞来完成。颗粒细胞可以把葡萄糖或乳酸盐转变成卵子可以利用的丙酮酸盐。丙酮酸盐或丁酮二酸盐可以支持小鼠裸卵减数分裂到ΜⅡ阶段,但葡萄糖、乳酸盐或者磷酸烯醇丙酮酸盐并不能起到相同效果。研究证实,线粒体的氧化代谢比葡萄糖的无氧代谢对哺乳动物卵子的能量生产更加重要。颗粒细胞将葡萄糖转变为卵子可以吸收的丙酮酸盐,表明颗粒细胞对卵子成熟营养环境的重要影响。丙酮酸钠可以在不加血清的成熟培养液中支持和促进牛裸卵的核成熟。然而,报道指出仅仅有丙酮酸盐并不能有效地支持卵子的胞质成熟。尽管如此,糖酵解代谢的信号通路反映了在卵子成熟阶段,存在着很多参与控制基因的表达、控制和堆积的机制。此外,报道指出,葡萄糖通过Embded-Meyerhof路径的代谢在牛卵子成熟过程中是很重要的。目前,并没有关于人类卵子的代谢途径的直接信息。tdN试管婴儿网

小鼠实验表明,无论有没有有丝分裂抑制素的出现,小鼠卵母细胞的IVM都会伴随着卵子cAMP含量的降低。而葡萄糖会导致COCs中cAMP 含量的升高,同时伴随着在添加次黄嘌呤培养液中GVBD的降低。丙酮酸盐直接影响小鼠卵子的核成熟。虽然报道指出葡萄糖会对人类裸卵的IVM产生抑制作用 ,但是我们的实验表明在成熟液中添加适量的葡萄糖对牛和人类卵子的核成熟及胞质成熟有益处。tdN试管婴儿网

必需氨基酸和非必需氨基酸经常被添加到含有血清或不含血清的胚胎体外培养液里面。对于很多种类的动物的胚胎,在培养液里面添加氨基酸对胚胎的发育是有益处的。氨基酸除了蛋白合成的作用,也是非常重要的渗透物,细胞内的缓冲剂、重金属的螯合剂和能量的来源、多种生理调整素 (physiological regulators)的起始物如一氧化氮和聚胺。报道还指出,添加有氨基酸的培养液对老鼠囊胚体外培养的葡萄糖代谢有所影响。虽然,有些报道指出,氨基酸可以支持兔卵、仓鼠卵、猪卵和牛卵的成熟,氨基酸的添加对于人卵IVM的必要性尚不完全清楚。来自我们实验室的结果表明在培养液中添加必需氨基酸对牛卵胞质成熟和支持进一步的胚胎发育是必需的。而且,非必需氨基酸和必需氨基酸对于卵子的胞质成熟起到了相辅相成的作用。tdN试管婴儿网

据报道,在胚胎培养液里面加入水溶性维生素,特别是纤维醇,可以提高兔和仓鼠囊胚的孵化率 。维生素会影响小鼠卵和羊卵的葡萄糖代谢。然而,关于培养液中维生素的添加对未成熟卵子的成熟和发育的影响方面的信息还很有限。牛的胚胎发育研究指出,在卵子成熟培养液中添加维生素对牛的胚胎发育很重要。根据动物实验,我们设计了一种新的IVM培养液,而且证实了这种IVM培养液对于从刺激或者未刺激周期取得的未成熟人卵的核成熟与胞质成熟都有益处。tdN试管婴儿网

在复合的培养中液添加多种血清、促性腺激素(FSH或LH)、雌二醇在临床中已广泛用于人类卵母细胞IVM的研究。IVM研究已经证实了在培养液中加入生长激素会诱导COC减数分裂的恢复。此外,在IVM培养液中添加胰岛素可以刺激小鼠和牛未成熟卵母细胞的成熟和受精后囊胚的形态发育。tdN试管婴儿网

未成熟的COC被培养在IVM培养液中,要经历24~48小时的IVM过程。经过24小时的培养,所有的COC会被脱去颗粒细胞来识别成熟程度。COC会被暴露在可以购买到的透明质酸酶中1分钟,然后用精细的玻璃管来脱掉颗粒细胞。成熟的卵子随后用IVF或者ICS1的方法授精。剩下的未成熟卵子(GV或ΜⅡ)将被继续培养24小时。在取卵后48小时(IVM培养),余下的裸卵将再次被检验,其中成熟的卵子将立即通过IVF或者ICSI方法受精。 tdN试管婴儿网

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