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培养环境

作者:金美善 来源:人民卫生出版社 2015-08-29 17:32:13

核心提示: 1.3 培养环境1.3.1 pH(一)细胞内pH(pHi)培养环境的pHe对培养液中生物体的影响不同。如原牛动物细胞就对培养液的pH变化不甚敏感,在pHe为5.75~7.4的培养液中可以维持7.15的pH

      1.3 培养环境dOb试管婴儿网

1.3.1 pHdOb试管婴儿网

(一)细胞内pHpHidOb试管婴儿网

培养环境的pHe对培养液中生物体的影响不同。如原牛动物细胞就对培养液的pH变化不甚敏感,在pHe5.757.4的培养液中可以维持7.15pHi。为了观察人卵母细胞对pHe的调节能力,Dale等通过在胞质内注射pH指示剂二羧羧基荧光素(bis-carboxyethylcarboxyfluoresceinBCECF)时发现,人卵母细胞在不同阶段的pHi均为7.4。这一水平被认为是生理pH,而且,将卵母细胞罝于pH 8.07.57.0的培养液中时,其胞质内pH也随着pHe发生相应的变化。在pH 8.07.5培养液中的卵母细胞经过一段时间重新获得pHi 7.4水平时,pHe 7.0中的卵母细胞却一直保持了pHi 7.0水平。这一观察说明,人卵母细胞pHi随着pHe发生变化而且其对pH环境变化的能力有限,特别是对酸性环境无应对能力。继而在2000年,Philips等做了一个被很多人认为是经典的研究,他们将人28细胞卵裂期胚胎在含有沖pH荧光指示剂SNARF-1-AM的培养液中平衡后观察到,其胞质内的平均为pHi 7.12 ± 0.008n=199),不同阶段差异甚小。而且卵裂期胚胎对碱性环境的调节能力依赖于培养液中C1-的存在,说明细胞膜中存在HCO3-/ C1-离子交换系统,而这个研究最值得注重的事实是这个交换系统启动的阈值为7.27.3,也就是说,超过这个pHi时,细胞就会开始应对所谓的“碱性环境”了。而胚胎对酸性环境的调节则依赖于Na-/H+Na+/ HCO3- 系统,启动阈值为6.86.9,可以调节pHi7.1的水平。总之,人卵裂期胚胎可以通过以上途径较准确地调整pHi使其保持在7.17.2的范围。dOb试管婴儿网

(二)培养液的pHpHedOb试管婴儿网

在培养过程中,一个令人困扰的问题是确定最佳靶pHetarget pHe)范围,即细胞pHe是否应该和pHi完全一致,或是否应该略高于或略低于胚胎细胞的pHi 。目前,多数研究者倾向于使用比胚胎细胞pHi略高的pH作为最佳靶州pHe 。因为细胞膜的负电位会吸引培养液中的进入细胞膜,但更主要的是胚胎细胞内的代谢产物会降低pHi从而影响胚胎的正常新陈代谢。但平衡后的最高pH最好不超过74,因此多数培养液的CO2水平可以设置在6%7%,使得pHe保持在7.3左右的水平。dOb试管婴儿网

同的培养液制造厂家所提供的培养液对CO2浓度和pH标准有所不同。G1TM Vitrolife)在6% CO2中平衡后的pH标准为7.207.34 Quinns Advantage® Cleavage Medium TM COOK )在6% CO2中平衡后为7.37.5(或7.257.54),EmbryoAssistTMOrigio)为7.27.3(或7.157.34)等(数据于2011-04-26取自各厂家网站的相关产品信息)。用于卵裂胚培养的产品pH标准间的这种差异代表了产品组分、制造过程和终端产品质量控制的严格程度。对一个生殖中心而言,检测pH的目的不仅是为了检查培养液的质量以确认pHe是否符合制造厂家所设定的标准,更重要的是了解并调整pHe使胚胎在最适合的pHe环境中正常发育。dOb试管婴儿网

(三)pH测试dOb试管婴儿网

观察和测定pH的方法有多种。当培养液中含有酚红时,其颜色的改变可以指示培养液pH变化, 因此,可以采用目测法观察pH的变化。但是,观察一个试管中的培养液pH变化时,其最大敏感度只能达到0.2 pH单位。因此,根据目测法常会影响pH正常判断。dOb试管婴儿网

  近年来,考虑到酚红为非生理性物质和对酚红的雌激素样结构的质疑等,很多培养液已不采用酚红作为培养液添加剂。dOb试管婴儿网

  用常规pH测定仪测定pH比较经济,如果严格遵循正确的测试方法,可以相对准确地获得培养液或液滴中的pH。使用pH测定仪时需要注意如下问题:dOb试管婴儿网

  (1)应选用精密度较高的pH测定仪。dOb试管婴儿网

  (2pH电极在测试标淮缓冲液时要符合标准电压要求。dOb试管婴儿网

  (3)尽量使用一次性pH标准液,采用标准液7.00 10.00作校正,用标准液8.00确认校正结果。dOb试管婴儿网

  (4)应该在37条件下测试,如果在室温下测试,所得pH会有较大的差异。dOb试管婴儿网

  (5)被测试培养液的预平衡时间和条件应该正确和充分。 dOb试管婴儿网

  (6)测试应该按争取的标准操作程序进行。dOb试管婴儿网

关于pH测试方法,见附录一。dOb试管婴儿网

pH测定仪相比,血气分析仪(如Viasala)更适合测定培养液,特别是微滴的pH变化。这一方法简单、准确和可靠,但有价格较高的缺点。 dOb试管婴儿网

  (四)培养液pH的维持 dOb试管婴儿网

  为了维持碳酸盐缓冲系统的pH稳定,需要考虑到如下几点:第一,尽量缩短在培养箱外操作的时间;第二,用MOPSHEPES缓冲系统做取卵和显微操作等操作;第三,在可能的情况下,尽量使用培养油以减缓CO2挥发;第四,选用婴儿培养箱进行体外操作。

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