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培养液

作者:金善美 来源:人民卫生出版社 2015-08-31 11:52:55

核心提示: 在体外培养人胚胎的目的是使胚胎保持持续性活力并使其在一定的时间内达到最伴发育阶段。一个优化的培养系统可以支持有活力的胚胎在体外或在移植后能够形成囊胚并有能力发

      在体外培养人胚胎的目的是使胚胎保持持续性活力并使其在一定的时间内达到最伴发育阶段。一个优化的培养系统可以支持有活力的胚胎在体外或在移植后能够形成囊胚并有能力发育成胎儿。优化的培养系统不仅与所使用的培养液有关,而且与很多相关的因素有着密切联系,如培养中所用的气体环境(低氧)、培养油、培养用器皿、培养箱、胚胎液滴容量比、培养方法、质量控制、质量管理及操作人员培训等。只有从整体的角度去不断改善培养系统,才可以获得最佳培养效果。1dD试管婴儿网

1.1 培养液1dD试管婴儿网

培养液对体外胚胎培养的重要性是不言而喻的。培养液的组分种类、组分含量和含量比、pH、渗透压等对胚胎的培养有直接的影响。1dD试管婴儿网

1.1.1 培养液的研究史1dD试管婴儿网

  体外培养(in vitro culture)法,顾名思义,就是将体外组织、细胞或器官从体内或其寄生体内取出,放在类似于体内牛存环境的体外环境中让其生长发育的方法。体外培养技术已有100多年的发展历史,初期发展进程比较缓慢,也没有引起很多学者的重视,直到20世纪50年代后期,这项技术才广泛应用于生物学研究的各个领域,得到快速发展。1dD试管婴儿网

1956年,Whitten用含有葡萄糖和小牛血清白蛋白的碳酸氢盐培养液将小鼠8细胞胚胎培养到囊胚,这使得体外培养技术首次应用于胚胎学研究。Mintz则用含0.002% 酚红和1.0mg/ml乳酸的50% 小牛血清与50% EBSS成功地培养了嵌合体小鼠。其早期的工作包括为防止液滴中钙离子沉淀而将Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液中的钙离子浓度从2.54mmol/L降低为1.71mmol/L,这一调节至今仍沿用在很多培养液的配方中。同时,Brinster阐明了乳酸可以支持2细胞小鼠胚胎发育,小鼠胚胎的首选能量来源是丙酮酸而非葡萄糖。Biggers等也随后证明,小鼠杂合子到2细胞胚胎的发育过程依赖于丙酮酸,而葡萄糖则对4细胞到8细胞小鼠胚胎发育起支持作用。基于这些研究,BMOC培养液(Brinsters Medium for Ovum Culture,)得以问世。随后,在BMOC培养液的基础上,Whitten培养液和M16培养液也相继用于胚胎培养。M16培养液可能是胚胎培养中应用最广泛的培养液,而含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸(N-hydroxyethylpiperazine-N-ethanesulfonateHEPES)的M16因可以在培养箱外在较短的时间内保持相对稳定的pH,后来被广泛用于体外受精的显微操作过程中。1dD试管婴儿网

  然而,在M16等常规使用的培养液中培养小鼠杂合子到囊胚阶段则只限于个别近交系小鼠和F1杂交系。大部分近交系和远交系的小鼠胚胎发育均阻滞在2细胞阶段,如CF1种系等。小鼠胚胎在发育中出现的2细胞阻滞现象被认为与其卵母细胞而非与其精子相关,而且这一阻滞是可以克服的,如可以通过将胚胎移植到小鼠体内输卵管或体外培养的输卵管内,通过注射不具有2细胞阻滞现象的F1杂交系小鼠卵母细胞的胞质或通过在培养液中加入乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetracetic acid EDTA)等重金属螯合物。而在Whitten培养液中加入EDTA显然可以协助某些小鼠种系从杂合子发育到囊胚,这是EDTA在培养液中的早期应用。1dD试管婴儿网

  这一系列的研究使得多种用于小鼠近亲交配和F1杂交胚胎的培养液问世,如CZBMTFBMOCCZM16T6EBSS以及KSOM等。除此之外,含有多种组分的支持体细胞培养的培养液如Hams F10也被开始用于胚胎培养中。这些动物胚胎培养用的培养液成为后来被用于生殖医学治疗中人胚胎培养的培养液的基础。1dD试管婴儿网

1.1.2 培养液的分类1dD试管婴儿网

    根据培养液的组分,胚胎培养液可分为简单和复合两种培养液。1dD试管婴儿网

   (一)简单培养液1dD试管婴儿网

这类培养液的共同特点是成分比较简单明确,培养液中往往加有丙酮酸、乳酸以及葡萄糖等胚胎发育所必需的能量物质,而不含氨基酸等复合成分。它们是60年代在鼠胚培养基础上发展而来的。这类培养液的代表有EBSSEarles Balanced Salt Solution)、HTFhuman tubal fluid,)等,前者是由Tyrode溶液改良而成,而后者则是模仿人体内输卵管液的高钾环境配制所得,它们都可用于人类早期胚胎培养。Edward1981年发表于Nature中提到的早期用于人胚培养的培养液即为EBSS HTFIVF-30P1等就是用于早期人胚胎培养的简单培养液。这些简单培养液需要在添加血清或血清蛋白后使用,多用于合子到卵裂胚的培养(表6-1)。1dD试管婴儿网

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